Proyecto de investigación:
Diseño de fármacos antibacterianos, estudios in vitro y de dinámica molecular para la caracterización bioquímica, estructural e inhibición de la Shikimato cinasa de Staphylococcus aureus resistente a meticilina.

Nombre del investigador responsable:
Claudia Isela Avitia Domínguez
Área de conocimiento:
Ciencias de la vida
Disciplina:
Bioquímica
Fecha en que inicia el proyecto:
30 de julio, 2016
Fecha en que termina el proyecto:
29 de julio, 2019
Tipo de financiamiento con que se realiza el proyecto:
Externo (otorgado por alguna institución distinta a la UJED).
Fuente de financiamiento:
CONACyT
Nombre de la convocatoria mediante la cual se obtuvo el apoyo (nombre, tipo y año).
Convocatoria 2015. CB-2015-01.

Información del protocolo

Protocolo

Las infecciones nosocomiales (IN), son un problema de importancia clínica y epidemiológica debido a que condicionan mayores tasas de morbilidad y mortalidad, con un incremento consecuente en el costo social de años de vida potencialmente perdidos, años de vida saludables inhabilitados por muerte prematura o vividos con discapacidades, lo cual se suma al incremento en los días de hospitalización y al gasto económico. El término nosocomial aplica a cualquier enfermedad contraída por un paciente mientras se encontraba bajo cuidados médicos (NOM-045-SSA2-2005). A nivel mundial se reportan de 10-15 millones de IN al año, esto significa un total de 1.4 millones de pacientes, con una letalidad del 1% (>100,000 muertes) y un costo mayor a los 30,000 millones de dólares por año. El costo promedio de un paciente sin adquirir una IN se estima en 44,000 dólares, mientras que el costo de un paciente con el mismo diagnóstico y la misma severidad de la enfermedad que adquiere una IN es de 173,000 dólares (CENAVECE, 2013). El 90% de las IN, son causadas por bacterias como Staphylococcus aureus (Bereket y cols., 2012).

S. aureus es reconocido como el patógeno nosocomial más importante, causante de infecciones humanas en todo el mundo (Diekema y cols., 2001). Aproximadamente el 20% de los individuos son colonizados constantemente por vía oral, y el 30% son colonizados intermitentemente. Posee la capacidad excepcional de adquirir resistencia a los antibióticos y provocar una gran cantidad de infecciones que varían desde infecciones leves en la piel hasta neumonía necrotizante fatal. El principal impacto de este patógeno se debe a las cepas de S. aureus resistentes a meticilina (SARM), término utilizado para describir a las cepas de S. aureus resistentes a meticilina y otros antibióticos ¿-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos) así como a antibacterianos no relacionados estructuralmente como tetraciclinas, macrólidos, quinolinas y aminoglucósidos, (Lowy., 1998). Las infecciones por SARM matan aproximadamente a 19,000 pacientes hospitalizados anualmente; esto es similar al número de muertes debidas a SIDA, tuberculosis y hepatitis viral combinadas (Klevens y cols., 2007). La pérdida de la eficacia de los tratamientos existentes para combatir las infecciones provocadas por SARM, la severidad de los efectos secundarios, la toxicidad; pero sobretodo, la aparición constante de cepas resistentes, crean la necesidad de buscar nuevos agentes contra esta bacteria.

En este sentido, un enfoque es la búsqueda de inhibidores de enzimas importantes en el metabolismo de la bacteria, los cuales puedan servir como guías o líderes en el diseño de un nuevo fármaco en contra la misma. Bajo esta perspectiva, una ruta esencial en el metabolismo de S. aureus es la Ruta del Shikimato. Está ruta une el metabolismo de los carbohidratos a la biosíntesis de compuestos aromáticos. El producto final de la ruta, el corismato, es el precursor de metabolitos tales como aminoácidos aromáticos, folatos y ubiquinona. Una característica fundamental para los fines del presente proyecto es que esta ruta no se encuentra presente en el humano (Bentley., 1990). Dentro de las enzimas de la Ruta del Shikimato se encuentra la shikimato cinasa (SK), considerada como un excelente blanco para el diseño de fármacos antibacterianos (Blanco y cols., 2013). La SK cataliza la conversión de shikimato (SHK) en shikimato 3-fosfato, usando ATP como co-sustrato (Whipp y Pittard., 1995). Existe evidencia que sugiere que la SK actúa como paso regulatorio de la ruta del shikimato, facilitando el flujo metabólico hacia almacenes específicos de metabolitos secundarios (Gorlach y cols., 1995). Además, se ha demostrado que la deleción del gen aroK, el cual codifica para la SK, causa la acumulación de shikimato, lo cual sugiere que este es un punto interesante para bloquear la ruta (Chen y cols., 2012).

A la fecha, existen pocos reportes sobre inhibidores de esta enzima en otras bacterias (Cheng y cols., 2012; Blanco y cols., 2013). En lo que se refiere a este punto, es importante mencionar que con respecto a la SK de SARM (SaSK), no hay reportes en la literatura, al menos hasta donde nuestro grupo de trabajo tiene conocimiento. De hecho el responsable técnico de la presente propuesta publicó el primer reporte de otra de las enzimas de la ruta en esta bacteria (Avitia-Domínguez y cols., 2014).

Objetivo general

Caracterizar la shikimato cinasa de Staphylococcus aureus resistente a meticilina y obtener moléculas capaces de inhibir su catálisis, las cuales puedan servir como guías en el diseño de un nuevo fármaco contra esta bacteria.

Objetivos específicos

  1. Clonar y sobreexpresar el gen que codifica para la SaSK.

  2. Purificar y caracterizar cinética, fisicoquímica y estructuralmente la SaSK.

  3. Buscar moléculas pequeñas mediante cribado de alta eficiencia (HTS) que tengan la capacidad de inhibir a la SaSK.

  4. Caracterizar el mecanismo de inhibición de las moléculas más potentes mediante cinética enzimática y calorimetría de titulación isotérmica.

  5. Realizar un análisis estructural del complejo SaSK-inhibidor mediante dinámica molecular.
6.-Determinar la Concentración Inhibitoria Media (CIM) de las moléculas más potentes en cultivos de SARM.

Metas propuestas

  1. Primer periodo:
    • Contar con un fondo genético para sobreexpresar la SaSK.
    • Tener purificada y caracterizada cinética y fisicoquímicamente la SaSK.
    • Contar con la estructura cristalográfica de la SaSK.
    • Tener publicado un artículo de divulgación en el área del diseño de fármacos.
  2. Segundo periodo:
    • Iniciar el cribado de alta eficiencia de la base de datos de moléculas pequeñas (aproximadamente 2000), para la búsqueda de inhibidores de la SaSK.
    • Terminar el cribado de alta eficiencia de la base datos de moléculas pequeñas.
    • Seleccionar las moléculas con la mejor capacidad de inhibición de la SaSK.
    • Conocer el mecanismo de inhibición de las moléculas más potentes.
    • Presentar el trabajo en un congreso nacional y un internacional.
    • Contar con una publicación en una revista científica internacional indizada.
    • Titular un estudiante de Maestría en Ciencias.
  3. Tercer periodo:
    • Tener el análisis estructural de la interacción SaSK-inhibidor mediante dinámica molecular.
    • Establecer las características estructurales que debe tener una molécula pequeña para inhibir la SaSK.
    • Contar con la CIM de los inhibidores en cultivos de SARM.
    • Presentar el trabajo en un congreso internacional.
    • Contar con una publicación en una revista científica internacional indizada.
    • Titular a un estudiante de maestría y a uno de doctorado.

Fuente de la información

Dirección de Posgrado e Investigación


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